消化液常在貼附型細胞原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)過程中用來分散組織或細胞團,以達到離散細胞,獲得細胞懸液的目的。目前常用的消化液主要有胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液以及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA—2Na)液。其中,胰蛋白酶溶液是使用范圍zui廣的消化液;EDTA—2Na由于消化能力較弱,常與胰蛋白酶混合使用;膠原酶則多用于原代培養(yǎng)中將特殊組織的細胞與膠原成分的分離。一般來說,這些消化液可以單獨使用,也可以按一定比例混合使用,這主要取決于處理細胞類型的不同。
1)胰蛋白酶液
胰蛋白酶(Trypsin)是一種黃白色粉末,來自?;蜇i的胰臟。當其水解蛋白質(zhì)時,作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,除去細胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細胞骨架,從而使細胞分離。胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白質(zhì)的能力來表示,常用的有1:125和1:250兩種,即1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織使用。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質(zhì)密切關。不同的細胞對胰蛋白酶液的濃度、溫度和作用時間等要求也不一樣。一般來說,濃度越大、溫度越高、作用時間越長,對細胞的分離能力也越大,但超過一定限度就會損傷細胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是O.25%和0.125%,作用溫度是37℃或室溫,pH 7.4左右:許多學者認為Ca 2+ 、Mg 2+和血清的存在都會降低胰蛋白酶的活力。為使胰蛋白酶達到松弛細胞間連接和深入至單層細胞基底面及外側(cè)面,細胞在進行胰蛋白酶液處理前,先用無Ca 2+、Mg 2+的D-Hank’s液洗滌,去除培養(yǎng)液剩留的血清、鈣及鎂離子;再用D—Hank’s液配制的胰蛋白酶液消化細胞,細胞一旦分散,即用血清培養(yǎng)液終止胰蛋白酶對細胞的繼續(xù)消化作用
胰蛋白酶液的配制方法如下:
①按實驗需要稱取酶粉,用少量D—Hank’s液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。
②加適量D.Hank's液(橙紅色),低速磁力攪拌(室溫和4℃間斷進行,室溫高于30℃時要減少酶液在室溫中的攪拌時間)至酶液溶解。
③溶解后的酶液(深紅色),濾過除菌,小瓶分裝,一20℃凍存。
2)二乙胺四乙酸二鈉液
EDTA—2Na是一種化學鰲合劑(商品名為Vorson),它對傳代細胞有一定的解離作用,并且毒性小,使用方便。常用D.Hank’s液配成O.02%EDTA工作液,經(jīng)高壓滅菌后使用。EDTA的作用原理為:一些組織細胞,尤其是上皮組織細胞,在生長過程中需Ca 2+和Mg 2+ 參與細胞間連接,維持組織的完整性,EDTA從細胞生存環(huán)境中奪取Ca 2+和Mg 2+ ,并與這些離子形成螯合物,從而使細胞分離。因此,胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA不可與膠原酶聯(lián)用.因為膠原酶的消化作用依賴于Ca2+。EDTA可損傷線粒體,它與核蛋白中的鈣、鎂離子結(jié)合,破壞核蛋白結(jié)構(gòu)。細胞長期處于無鈣環(huán)境,鉀離子濃度降低,細胞呼吸減弱。EDTA作用不受血清抑制,故消化后需*漂洗,否則會影響細胞生長。
3)膠原酶液
膠原是細胞間質(zhì)的主要成分,天然三股螺旋構(gòu)象的膠原在生理溫度和pH下,不能被其他任何蛋白酶水解,而只能被膠原酶(collagenase)降解。膠原降解后,可進一步被其他蛋白酶降解。目前從不同組織分離的膠原酶有20多種,作用于天然膠原分子的N端1/4處,水解甘氨酸一異亮氨酸或甘氨酸一亮氨酸之間的肽鍵。不同批號或同一批號不同日期的膠原酶,其質(zhì)量都有差異。目前國內(nèi)多數(shù)實驗室使用的膠原酶,大多是從芽孢桿菌中提取出來的。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶中含梭茵肽酶(0.57~0.59 μg/mg),具有較強的細胞毒性,能破壞細胞膜上的蛋白多肽,從而改變細胞膜的通透性,因此用它消化組織時,應采取多步收集法(20.30 min/次),這樣才可獲得完整細胞膜和zui大活細胞收率。膠原酶在Ca 2+和Mg 2+存在下仍有活性,血清亦不能抑制其活性,故消化后應充分漂洗。不同來源的膠原酶對于不同類型的膠原的作用強弱不等。
膠原酶液的配制方法如下:膠原酶用基礎營養(yǎng)液配制。常用劑量為200 μg/mL或0.1~0.3 mg/mL。膠原酶粉用基礎營養(yǎng)液調(diào)成糊狀,液體加至定量后,磁場攪拌至基本溶解。濾過除菌,按1次用量分裝,一20℃凍存。
此外還有鏈霉蛋白酶(pronase,酶活性不能被血清終止,適合消化道黏膜細胞、kupter細胞等分離)、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase,作用細胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸)、DNA酶(deoxyribonuclease,作用破碎細胞釋放的DNA,酶活性可被Mg 2+和Ca 2+活化)、中性蛋白酶(dispase,用于上皮細胞分離)等。這些酶價格昂貴.只在獲取某類特殊細胞的情況下使用。由于酶作用的特異性,單一酶水解蛋白的能力有限。采用混合酶作消化劑,如利用DNA酶和胰蛋白酶分離小鼠胚胎成纖維細胞,利用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶分離大鼠心室細胞,效果會更好。