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病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間:2015-11-13   點(diǎn)擊次數(shù):1684次

病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

(1)原理:很多病毒都有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的作用,尤以致癌病毒zui為明顯。EB病毒(EBV)是近年來常用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的病毒。該病毒對人二倍體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果,常用于建立淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞系。人外周血B淋巴細(xì)胞膜上有。EB病毒受體,當(dāng)EB病毒與受體結(jié)合后,B淋巴細(xì)胞可發(fā)生轉(zhuǎn)化,成為體外長期傳代生長的細(xì)胞系。

(2)材料

1)病毒:EB病毒液(取自培養(yǎng)的B95—8細(xì)胞)。

2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞:檸檬酸或肝素抗凝人外周血。

3)細(xì)胞培養(yǎng)液:含20%胎牛血清的RPMI 1640。

4)抗生素:青霉素、鏈霉素和慶大霉素。

5)洗液:PBS。

(3)方法

1)血液制備:抗凝全血1~2ml,分裝于15ml離心管中,每管O.5ml,置于4℃冰箱中放置30min后,加入不含血清的RPMI1640離心洗一次,用含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。

2)EB病毒的獲得:培養(yǎng)的B95—8細(xì)胞,10000r/min離心15min去除細(xì)胞碎片,再經(jīng)24000r/min,離心90min獲得病毒沉淀,以1:100體積培養(yǎng)液溶解獲得EB病毒濃縮液。

3)EB病毒轉(zhuǎn)化:加入EB病毒液,O.3~0.5ml/管,37℃水浴30min~2h,并不時(shí)搖動,以利于病毒吸附和并防止血凝塊產(chǎn)生。

4)分裝入50ml培養(yǎng)瓶中,同時(shí)補(bǔ)加培養(yǎng)液,5ml/管,置入含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)。

5)細(xì)胞培養(yǎng)一周后再補(bǔ)入2ml培養(yǎng)基。

6)每3~4d加液或半量換液,隨細(xì)胞數(shù)量增多,可分裝人大瓶中培養(yǎng)。為了提高轉(zhuǎn)化效率,常將全血凍存復(fù)蘇后采用。

(4)結(jié)果觀察與鑒定:需每天鏡檢培養(yǎng)物,開始培養(yǎng)時(shí),鏡下可見大量紅細(xì)胞,難以觀察到單核細(xì)胞。培養(yǎng)5~7d后,單個(gè)或成團(tuán)的淋巴細(xì)胞增殖迅速,成大團(tuán)塊,呈懸浮生長,紅細(xì)胞已*消失,轉(zhuǎn)化完成。

 

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