ELISA試劑盒程序
(1) 壓跡:根據(jù)樣品的數(shù)量剪取一片硝酸纖維素膜或混合纖維素膜。用直徑3~5mm圓形打孔
器(瓊脂平板打孔器),在膜的光滑面按順序壓上痕跡,作為點(diǎn)樣部位。將膜置蒸餾水中浸泡,待*浸濕后,取出室溫自然干燥。
(2) 點(diǎn)樣:用微量移液器分別吸取1~2μl(或用玻璃棒、毛細(xì)管蘸一滴)被檢抗原液,滴于
圓圈內(nèi),自然干燥。為增加抗原吸附量,也可在點(diǎn)樣干燥后,再進(jìn)行第二次點(diǎn)樣。同時(shí)作陰、陽(yáng)性抗原對(duì)照。
(3) 封閉:將膜置平皿或小池內(nèi),加入封閉劑,37℃浸泡30~60min。取出稍置片刻,用洗液漂洗2次,晾干。
(4) 與AFMcAb或OFPcAb反應(yīng):用保溫液對(duì)AFMcAb或OFPcAb作適當(dāng)稀釋,加入反應(yīng)池中,于37℃覆蓋膜2h。
(5) 洗滌:用洗滌液漂洗膜3次,每次3min,晾干。
(6) 與酶結(jié)合物反應(yīng):凍干辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗BALB/c鼠抗體用保溫液作1∶80稀釋,37℃覆蓋膜1h。
(7) 洗滌:3次,方法同上。
(8) 顯色:將膜浸入底物溶液中,避光染色5~15min。
(9) 終止反應(yīng):用蒸餾水漂洗濾膜,晾干。
3 結(jié)果判定在陰、陽(yáng)對(duì)照正常情況下,以在膜圓圈內(nèi)出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)為陽(yáng)性,無色為陰性。膜干燥后,可長(zhǎng)期保存。
在應(yīng)用D4 注意事項(xiàng)
1 點(diǎn)樣量不易過大,以免溢出壓跡圈外,造成各樣品混合,如要增加樣品吸附量,可在一次點(diǎn)樣干燥后,再進(jìn)行第2次點(diǎn)樣。
2 膜包被后,一定要封閉確實(shí),防止抗原或抗體的非特異性吸附,避免膜本底染色過深。
3 結(jié)果判定時(shí),應(yīng)與陰、陽(yáng)性對(duì)照斑點(diǎn)反復(fù)比較,ELISA試劑盒盡量克服肉眼觀察所帶來的誤差。