親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成,可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。生物素在人體內(nèi)是不能單獨(dú)起作用的,它需要與其他酶、氨基酸脂肪衍生物等結(jié)合來(lái)綜合調(diào)控。生物素結(jié)合常數(shù)即表示了它與其他有機(jī)分子結(jié)合能力的大小。
現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈親和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱(chēng)維生素H,分子量244.31,存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合,雖不屬免疫反應(yīng),但特異性強(qiáng),親和力大,兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類(lèi)似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái),就可大提高ELISA的敏感度。
親合素主要包括卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類(lèi)親合素等。后兩種因其特異性親合力低,研究不多,前兩種目前已深入研究并得到廣泛應(yīng)用:
1、卵白親和素:親合素又稱(chēng)卵白蛋白或抗生物素,分子量為68000,pI 10~10.5;在pH9~13緩沖液中性質(zhì)均穩(wěn)定,耐熱并耐多種蛋白水解酶的作用。天然親合素為堿性蛋白,由4個(gè)相同的亞單位構(gòu)成4聚體;每個(gè)親合素亞單位通過(guò)其結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基與生物素中的Ureido環(huán)(I環(huán))結(jié)合。因此,1個(gè)親合素分子存在4個(gè)與生物素分子結(jié)合位點(diǎn),其結(jié)合常數(shù)(Ka)高 達(dá)1015mol/L。通常,親合素的活性單位是以親合素結(jié)合生物素的量來(lái)表示的,即以能結(jié)合1Pg生物素所需要的親合素量為1個(gè)親合素活性單位。一般1Pg親合素約含13~15個(gè)活性單位。
2、鏈霉親和素:鏈霉親合素(SA)是與親合素(A)有類(lèi)似生物學(xué)特性的一種蛋白質(zhì)。是由Streptomyces avidin菌在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物,SA也可通過(guò)基因工程手段。SA分子量為65000,由4條序列相同的肽鏈構(gòu)成,每條SA肽鏈可以結(jié)合1個(gè)生物素分子。因此與A一樣,每個(gè)SA分子也具有4個(gè)可與生物素分子結(jié)合位點(diǎn),其結(jié)合常數(shù)與A相同為1015mol/L。約為抗原抗體間ka(105~1011 mol/L)的1萬(wàn)倍以上。SA與A的ka雖然相同,但在實(shí)際應(yīng)用中其檢測(cè)靈敏度明顯優(yōu)于A,其原因是SA為 略偏酸性的蛋白。SA的每條肽鏈含159個(gè)氨基酸殘基,其中賴(lài)氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的含量比一般親合素少,反之含酸性氨基酸較多,其等點(diǎn)為6.0,較A(pI=10)為低,同時(shí)在結(jié)構(gòu)中SA不含任何糖基,而A含糖可高達(dá)10%。A的高pI及高含糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致在聚苯乙烯板和硝酸纖維素膜上或與組織細(xì)胞DNA結(jié)合時(shí),易產(chǎn)生一定程度的非特異性結(jié)合,造成較高的顯色背景,而SA較A在應(yīng)用中明顯克服了這一缺點(diǎn)。