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微生物菌種保藏
更新時(shí)間:2011-05-12   點(diǎn)擊次數(shù):2124次

5.1. 微生物菌種保藏
在發(fā)酵工業(yè)中,具有良好性狀的菌種的獲得十分不容易,如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù),使菌種經(jīng)長(zhǎng)期保藏后不但存活健在,而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型,特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)能力,即很少發(fā)生突變,這對(duì)于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多,但原理基本一致,即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑等方法,挑選優(yōu)良純種,是它們的休眠體,使微生物生長(zhǎng)在代謝不活潑,生長(zhǎng)受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有:蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔2?;干?載體保藏或冷凍干燥保藏;超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。

5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種zui簡(jiǎn)單的菌種保藏方法,只要將菌種懸浮于無(wú)菌蒸餾水中,將容器封好口,于10℃保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔2?
斜面?zhèn)鞔2胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng),然后在低溫條件下保存。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類(lèi)微生物的保藏,此法簡(jiǎn)單易行,且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代,目的是能淘汰突變株,同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏,以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)菌種的長(zhǎng)期保藏,一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線(xiàn)菌于4~6℃保存,每3個(gè)月移接一次;酵母菌于4~6℃保存,每4~6個(gè)月移接一次;霉菌于4~6℃保存,每6個(gè)月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒(méi)保藏
此方法簡(jiǎn)便有效,可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線(xiàn)菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏,操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油,礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,這樣可使菌種保藏時(shí)間延長(zhǎng)至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時(shí),應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn),因?yàn)槟承┚耆缃湍?、霉菌、?xì)菌等能利用石蠟為碳源,還有些菌株對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏,為了預(yù)防不測(cè),一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當(dāng)?shù)妮d體上,如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等,以保藏菌種。以沙土保藏用得較多,制備方法為:將河砂經(jīng)24目過(guò)篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h,以除去其中所含的有機(jī)物,用水漂洗至中性,烘干,然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中,121℃間歇滅菌3次。用無(wú)菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中,經(jīng)真空干燥8 h,于常溫或低溫下保藏均可,保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒,不需酸洗,經(jīng)風(fēng)干、粉碎,然后同法過(guò)篩、滅菌即可。一般細(xì)菌芽孢常用砂管保藏,霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏, 冷凍保藏為非常有效的方法。通過(guò)冷凍,使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言,冷凍溫度愈低,效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿(mǎn)意,通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑;同時(shí)還要認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃):將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上,待生長(zhǎng)適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好,于冰箱的冷藏室中貯藏,或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存?;蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi),嚴(yán)格密封后,同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過(guò)一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。這一方法雖簡(jiǎn)便易行,但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù):要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種,一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進(jìn)行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是:先離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞,再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞,然后加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜冷凍保護(hù)劑,混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過(guò)此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù):近年來(lái),大量有特殊意義和特征的高等動(dòng)、植物細(xì)胞能夠在液氮中長(zhǎng)期保藏,并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)的方法。具體方法是:把細(xì)胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進(jìn)行液體冷凍,然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進(jìn)行液氮冷凍保藏時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細(xì)胞懸液,分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏塑料瓶,玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃/min的致冷速度降溫,直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)。待細(xì)胞凍結(jié)后,將致冷速度降為1℃/min,直到溫度達(dá)到-50℃,將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī),則一般可用如下方法代替:將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h,然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中,zui常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油,zui終使用濃度一般為甘油10%、二甲亞砜5%。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌,而二甲亞砜為過(guò)濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到zui大穩(wěn)定期后,一般培養(yǎng)放線(xiàn)菌和絲狀真菌約需7~10天,培養(yǎng)細(xì)菌約需24~28小時(shí),培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護(hù)劑的溶液中,保護(hù)劑常選用脫脂乳、蔗糖、動(dòng)物血清、谷氨酸鈉等,菌液濃度為109~1019個(gè)/ml,取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍,再于減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華至1%~5%,使培養(yǎng)物干燥。zui后將管口熔封,保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的zui為有效的方法之一,大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏,便于運(yùn)輸。但操作過(guò)程復(fù)雜,并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展,越來(lái)越多的基因工程菌需要得到合理的保藏,由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復(fù)制子很容易丟失。另外,對(duì)于宿主細(xì)胞質(zhì)?;蛲ǔ樯L(zhǎng)非必需,一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí),生長(zhǎng)速度會(huì)加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類(lèi)質(zhì)粒的細(xì)胞群體時(shí)極為有用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí),抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí),抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。由此看來(lái)基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如,質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E.coli細(xì)胞外,還賦予E.coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet,則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。
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